时间安排

实训项目

具体内容

第一天

消毒与灭菌

无菌器材的准备

样品的稀释

无菌室的消毒灭菌使用

紫外线消毒、干热和湿热灭菌

无菌器材的准备

无菌操作样品的稀释

第二天

培养基制作

细菌分离培养技术

伊红美蓝基配制

斜面接种、划线分区接种

第三天

细菌简单染色

细菌革兰氏染色

细菌涂片技术

细菌简单染色、细菌革兰氏染色

镜检技术

第四天

水样标本细菌菌落总数测定

综合训练，完成检测实验

第五天

综合测试

测试无菌操作及染色技术、镜检技术

第六天

细菌菌落总数测定

细菌菌落总数测定结果及分析

项目

考核内容

操作标准

准备

正确准备

准备：穿着实验服，戴上橡胶手套、口罩，正确在血平板和待接种管做编号

无菌

无菌操作

无菌：左手持培养皿，打开皿盖约45-60°角，右手持接种环，在酒精灯8-10cm范围内进行无菌操作。

接种环

使用

灭菌、冷却、取菌

灭菌：点燃酒精灯，右手以持笔式握持接种环柄，将接种环垂直放在内焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底；

冷却：灼烧后的接种环需冷却，可触及琼脂表面无菌处或平皿盖处冷却（注：为评分标准的统一化，冷却操作动作需明显，不可在空气中冷却，防止引歧义，以下提到冷却均统一操作）；

取菌：冷却后的接种环挑取单个标本菌落，且培养基无划破。

分区

划线

第一区

第一区：将标本均匀涂布于平板边缘，约占平板的1/5，同时确保培养基无被划破，对接种环进行彻底的灼烧灭菌；

第二、三、四区

第二区：调整培养皿至适合操作的位置，灼烧后的接种环冷却（注：同上），将接种环通过第一区3-4次，进行连续不重叠划线，均匀流畅，培养基无划破，对接种环进行彻底的灼烧灭菌；

第三区：调整培养皿至适合操作的位置，灼烧后的接种环冷却（注：同上），将接种环通过第二区3-4次，进行连续不重叠划线，均匀流畅，培养基被划破，对接种环进行彻底的灼烧灭菌；

第四区：调整培养皿至适合操作的位置，灼烧后的接种环冷却（注：同上），将接种环通过第三区3-4次，进行连续不重叠划线，均匀流畅，不与第一区交叉，培养基无划破，对接种环进行彻底的灼烧灭菌，放置试管架上，培养皿需倒置。

斜面

接种

手持试管及

接种环

将菌种管与待接种管持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～60度角。右手持接种环进行灼烧灭菌（同上）。

接种

用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管塞，将试管口缓缓过火灭菌。

将灼烧灭菌的接种环伸入菌种管内，先接触无菌落生长的培养基，待冷却后再从斜面上挑取少许菌落，在火焰旁迅速伸入接种管，在斜面底部自下而上划一条线，再从底部向上做S形划线。接种完毕，取出接种环，灼烧试管口及管塞，并在火焰旁将管塞旋上，再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧管塞。

培养

倒置培养皿

操作结束，将待接种管和倒置的血平板置于35-37℃培养箱进行18-24h的培养。

文明

操作

实验台面清理

操作过程未造成培养基、桌面、身体衣物及环境污染，熄灭酒精灯，清理桌面上的实验废弃物。

项目

考核内容

操作标准

制片

滴加无菌生理盐水

涂片：取一洁净的载玻片，滴一小滴生理盐水于载玻片中央，按无菌操作要求（注：单手持无菌培养皿，打开皿盖约45°角，另一手持接种环，在酒精灯8-10cm范围内进行操作），用接种环挑取少量细菌于玻片中央水滴中，均匀涂布，形成直径约为1-1.5cm的菌膜，要求涂片薄而均匀。（注：涂片是否均匀将在镜检中进行判定）

干燥：为在规定时间内完成操作，可以利用酒精灯火焰温度干燥涂片，注意不能太靠近火焰（应在酒精灯火焰上方约半尺处），在固定之前要保证菌种细胞活性。

接种环的使用

涂片、干燥

固　定

固定：涂片干燥后，以钟摆速度将玻片（菌膜面朝上）通过酒精灯火焰3次，进行固定。   

革兰氏染色

初　染

初染：用结晶紫染液（使用塑料吸管，下同）覆盖涂菌部位，染色10s，水洗至流出水无色

媒染：用卢戈碘液覆盖涂菌部位10s，水洗至流出水无色。   

脱色：用95%乙醇脱色（持续10-20s），稍后立即洗去乙醇。   

复染：用沙黄染液染色10s，水洗至流出水无色。

媒　染

脱　色

复　染

干  燥

干燥：为在规定时间内完成操作，可以利用擦镜纸吸去玻片上残余水珠，进行干燥。

镜检 

显微镜的使用

①载玻片安置：移开镜套，插上电源，打开显微镜，将载玻片放置于载物台上并用标本夹夹住；

②调节光源：调节光源到适当的照明强度

③低倍镜观察：移动推进器使观察对象处于物镜的最下方，转动粗准焦螺旋，在视野中寻找物像，再略微转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。

④油镜观察：在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心，将低倍镜转离工作位置，在待观察的目标区域滴上一滴香柏油，将油镜转到工作位置，油镜镜头此时应正好浸泡在镜油中。调节照明使视野的亮度合适，微调细准焦螺旋使物象清晰。

染色结果判断

染色结果判定：在实验结果记录表上完成对染色细胞形状（球状或杆状）和颜色（紫色或红色）的描述，并判断细菌属于革兰阳性菌或革兰阴性菌。

显微镜清洁和归位

镜检完毕处理：

①缓慢下降载物台至最低位置，调节光源到最暗，关闭电源开关。

②取下载玻片。

③清洁显微镜：先用擦镜纸擦去油镜镜头上的香柏油，再用沾有少许二甲苯的擦镜纸擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸抹去残留的二甲苯（注：需要按同一个方向擦洗镜头）。

④清洁后，将物镜转成八字形，将推进器归位，拔下电源，罩上镜套。

文明

操作

实验后台面整理

操作结束，将载玻片放入消毒液中，用酒精灯盖子熄灭酒精灯（注：酒精灯应在制片结束后立即熄灭），清理桌面上的实验废品。

器皿破损

细菌革兰染色显微镜观察结果记录

形状描述：

细菌细胞颜色：

结果判断：

项目

考核内容

操作规范

称量

天平的准备

调节电子天平水平泡至中间位置。

称量前应先将电子天平调零。

称量操作

称量纸的边角应对折防止培养基撒出。

获取不同的培养基成分应使用不同的药匙，不同的称量纸，防止交叉污染。

药品称量完成后应盖好瓶盖并放回原位。

天平使用后应关机、清扫天平盘。

溶化

培养基溶化

先用量筒量取300ml蒸馏水，加入1/2左右的水到烧杯中，置于电热套上加热。先将蒸馏水加热是为了节省时间保证实验能够在规定时间内完成。此步骤可在称量前进行。

将培养基各种成分按配方称量好后，应及时放入烧杯中，防止部分培养基受潮粘在称量纸上。

培养基在溶解过程中需不断搅拌,防止培养基粘到烧杯底部引起培养基烧焦，溶解过程要注意调整火力防止培养基溢出，溶解至培养基澄清无沉淀，表明培养基溶解彻底。

将量筒内剩余的水加入到以上培养基中，搅拌混合均匀。

调酸

碱度

PH的测定

用玻璃棒蘸取少量培养基，在试纸一端点一下即可，根据酸碱度利用1mol/L NaOH和1mol/L HCl进行调节PH。

调节PH时需将培养基转移到烧杯中便于搅拌混匀,调PH值时，边滴加试剂边搅拌，并随时用PH试纸测量。

分装和包扎

分装

根据分装量可选择不同的量筒分装，分装过程中应注意操作防止培养基洒出。

本实验提供250ml的三角瓶用于分装培养基，一般装液量为100ml左右。

分装时应避免培养基粘附瓶口，以免引起污染。

包扎

分装完成后包好封口膜后，外面包牛皮纸一层或旧报纸二层，用绳正确捆扎，不打死结。

包扎完成后可在牛皮纸或报纸上面标注培养基名称、制备日期及制备人编号，并贴上灭菌指示带便于灭菌结束后判断培养基是否灭菌完全。

灭菌

灭菌锅的

使用

首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。一般来说每次灭菌前都应该加水。加水不能太少，否则会引起烧干或者爆裂。 加水最好加去离子水或蒸馏水，这样产生的水垢少些，而且锅体不容易被腐蚀。

放入培养基，加盖并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。然后盖严锅盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

盖严锅盖后接入电源，打开排气阀排气，准备灭菌。因时间限制，本实验将这一步作为实验完成标志。

文明

操作

实验后台面整理

台面的整理包括将各药品归位，以及实验台的整理等。

器皿破损

器皿破损主要指操作过程出现的玻璃板、烧杯、三角瓶等器皿的损坏情况。

项目

 考核内容

操作标准

菌  落  总  数  的  测  定

编号

用油性标记笔在所需的试管和培养皿皿底上做好标记，以便区分。

稀释

用10ml的无菌吸管吸取9ml无菌生理盐水到无菌试管中，用1ml无菌吸管吸取1ml水样，沿管壁缓慢注于盛有9ml无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液面），在涡旋振荡器上使其混合均匀，制成1:10的样品匀液。

加样、对照

选择原液和1:10这两个稀释度的样品匀液进行检测。吸取1ml样品匀液于无菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿，同时，吸取1ml空白稀释液加入到一个无菌培养皿内作空白对照。注意无菌吸管的合理利用，以免重复浪费。

制备平板

及时将15—20ml冷却至46℃的营养琼脂（事先置于46℃水浴锅）倾注到培养皿，并及时转动培养基使其混合均匀，以免培养基开始凝固后再混匀达不到效果。混匀时注意力度，勿使培养基污染皿盖或溢出。

培养

培养基未凝固时，培养皿应轻拿轻放，水平静置，待其凝固后方可倒置。

倒置培养皿后，将培养皿置于恒温培养箱中，培养温度为36℃±1℃，培养时间为48h±2h。（口述培养温度、时间）

文明

操作

实验台面

整理

等待培养基凝固的同时，利用等待的时间，整理实验台面。将废弃物扔至垃圾桶，已使用的吸管置于回收筒内。用酒精棉球擦拭污染的桌面（培养基若未溢出，可免擦拭）。